准备试剂

氯仿，异丙醇，75%乙醇，无RNase的水或0.5%SDS(溶液均需用DEPC处理过的水配制)。

操作步骤

1．匀浆处理

a、组织:将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml Typhon；肝脏、脑等柔软组织用匀浆仪进行匀浆处理。然后加入1mlTyphon，反复轻柔吹打，直至溶液不抽丝，样品体积不应超过Typhon体积10%。

b、单层培养细胞:去除细胞培养基，PBS冲洗一次，直接在培养板中加入Typhon裂解细胞，每250px2面积加1ml，用移液器吸打几次，转移至1.5ml离心管，反复吹打，直至溶液不抽丝。Typhon的用量应根据培养板面积而定。Typhon加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。组织匀浆仪

c、细胞悬液:离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml Typhon，反复吸打直至溶液不抽丝。加Typhon之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。

2．将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。

3．可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃ 12000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除，取澄清的匀浆液进行下一步操作。

4．第一步每使用1ml Typhon加入0.2ml氯仿，轻柔振荡或吹吸15秒，室温放置3分钟。

5．2-8℃ 12000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色或淡黄色水相，中间为固相。RNA主要在水相中，水相体积约为所用Typhon试剂的60%。

6．把水相转移到新管中（如要分离DNA和蛋白质可保留有机相），用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml Typhon加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。

7．2-8℃ 10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

8．用75%乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml Typhon至少加1ml 75%乙醇。2-8℃不超过7500×g离心5分钟，弃上清。

9．室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，不要晾得过干，否则不易溶解，大约晾5-10分钟。加入25-200μl无RNase的水或0.5%SDS（本公司均有售），用枪头吸打几次,55-60℃放置10分钟使RNA溶解。如RNA用于酶切反应，勿使用SDS溶液。RNA也可用100%的去离子甲酰胺溶解。-70℃保存。

RNA的提取注意事项  组织匀浆仪

1．从少量样品（1-10mg组织或102-104细胞）中提取RNA是可加入少许糖原以促进RNA沉淀。例如加800μl Typhon匀浆样品，离心取上清液后，异丙醇沉淀RNA前加5-10ug RNase-free糖原。糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml不影响第一链的合成，也不影响PCR反应。

2．匀浆后加入Typhon，加氯仿之前样品可在-60—-70℃保存至少一个月。RNA沉淀可保存在75%酒精中2-8℃一个星期以上或-5—-20℃一年以上。

3．分层和RNA沉淀时也可使用低速台式离心机，2600×g离心30-60分钟。